期刊年卷：Nat Med 2020 Nov 09

DOI: https://doi.org/10.1038/s41591-020-1105-z

作者：Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, Federman S, Gopez A, Reyes K, Zorn K, Sample H, Yu G, Ishpuniani G, Briggs B, Chow ED, Berger A, Wilson MR, Wang C, Hsu E, Miller S, DeRisi JL, Chiu CY,

影響因子：36.13

背景

快速準確的病原學診斷對于臨床制定感染患者的干預措施至關重要，由于大多數感染的臨床表現難以區(qū)分，對廣泛的、多元化的診斷技術需求非常迫切。有些微生物在培養(yǎng)過程中很難生長，或無法生長?；诰酆厦告準椒磻?(PCR) 的分子檢測需要提前預設，而針對細菌和真菌的 16S 核糖體 RNA 和 28S-ITS PCR 檢測的靈敏度仍需研究。

宏基因組測序可以從臨床樣本中檢測幾乎所有已知基因序列的病原體，從感染部位的體液中快速識別病原體是至關重要的。基于 Illumina 測序平臺的樣本到報告的周轉時間為 48-72h。相比之下，納米孔測序可以在開始測序后幾分鐘內檢測到微生物，整體周轉時間小于 6h。

本研究旨在通過一種通用建庫方案，同時適用于納米孔測序平臺和 Illumina 測序平臺，對不同體液中的游離 DNA(cfDNA) 進行 mNGS 測序，測試樣本涵蓋低細胞含量的腦脊液，以及高宿主 DNA 含量的膿液，用于評估 mNGS 的檢測性能（與傳統培養(yǎng)和 PCR 檢測進行比較）。

方法

采集 160 例患者的 182 份體液標本，其中膿液 25 例，關節(jié)積液 21 例，胸水 32 例，腹水 27 例，腦脊液 35 例，支氣管肺泡灌洗液 13 例，其他體液 29 例。在這 182 個樣本中，170 個用于評估 Illumina 平臺 mNGS 的準確性。連續(xù)收集的前 87 個樣本被用于比較納米孔測序和 Illumina 測序。

檢測時間

通過開發(fā)一套新的適用于納米孔測序和 Illumina 測序的通用建庫方案，Illumina 和納米孔測序的測序數據量中位數為 7.2M 和 1.1M。使用 SURPI 軟件進行數據分析。納米孔測序需 5 小時的建庫準備，平均測序時間為 50 分鐘，樣本到報告的總時間為~6 小時。 Illumina 測序的總周轉時間為~24 小時。

測試準確性

針對對于細菌、真菌病原體的檢測性能，使用了兩種參考標準進行判定：

1. 培養(yǎng)和 16S PCR 結果組成的臨床金標準；

2. 復合標準：（1）同時從同一患者采集的其他樣本類型的檢測結果；(2) 數字 PCR 測試結果；(3) 由傳染病專家 (C.Y.C.) 和臨床病理學家 (W.G.) 的獨立判斷結果。

對于 Illumina 測序，使用臨床金標準，mNGS 對細菌檢測的靈敏度和特異度分別為 79.2%(95% 可信區(qū)間 (CI)73.5-85.2%) 和 90.6%(95%CI 87.3-93.8%)，相比之下，納米孔測序分別為 75.0%(95%CI 65.0-85.7%) 和 81.4%(95%CI 74.1-89.3%)(圖 2C)。當使用復合標準時，Illumina 測序的陽性符合率 (PPA) 和陰性符合率 (NPA) 分別為 80.0%(95%CI 74.1-86.3%) 和 95.3%(95%CI 92.9-97.6%)，而納米孔測序的陽性符合率 (PPA) 和陰性符合率 (NPA) 分別為 81.0%(95%CI 72.4-89.7%) 和 93.0%(95%CI 88.5-96.7%)。真菌的靈敏度和特異度對于 Ilumina 測序 (n=127) 分別為 90.6%(95%CI 84.2-100%) 和 89.0%(95%CI 85.7-92.5%)，而對于納米孔測序 (n=127) 分別為 90.9%(95%CI 80.0-100%) 和 100%。

mNGS 診斷感染的潛在臨床價值

在 12 例培養(yǎng)和 PCR 為陰性的患者中，有 7 例通過 mNGS 確定了可能的病原體 (克雷伯氏菌、煙曲霉、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌、嗜沙門氏菌、近擬念珠菌和厭氧胃腸道菌群)。另外 2 例由血清學確診的神經性梅毒和球孢子菌患者，mNGS 成功檢測到病原體序列，但低于預先設定的 nRPM 報告閾值。在剩余 3 例患者中，mNGS 漏檢了胸水中的新生隱球菌 (由培養(yǎng)陽性的 BAL 液作診斷)、胸水中的結核分枝桿菌 (MTB)(由陽性淋巴結培養(yǎng)作出的診斷) 和芽胞絲狀芽胞桿菌 (Sporothrix sp.)。

mNGS 與細菌 16S 和真菌 28S-ITS PCR 的比較

在 160 名患者中有 14 例進行了 16S 或 28S-ITS PCR 檢測。其中有 8 例 mNGS 檢測結果與 PCR 結果一致。三個不一致的細菌病例中，第一例胸水 16S PCR 檢測顯示鏈球菌屬，而 mNGS 檢測確認肺炎克雷伯菌。第二例體液培養(yǎng)和 16S PCR 檢測均為陰性，而從神經外科手術移除的腦深部刺激器 (DBS) 中隨后的 mNGS 與培養(yǎng)結果顯示產氣克雷伯菌呈陽性。第三例不一致病例為膿液，16S PCR 檢測禽型分枝桿菌復合體陽性，mNGS 檢測陰性。在三個不一致的真菌病例中，體液 mNGS 能夠找到致病微生物，而真菌 28S-ITS-PCR 檢測為陰性。

體液和血漿 mNGS 診斷的比較

有 7 名患者（攜帶 9 種病原體），同時進行體液和血漿 mNGS 檢測。病原體 cfDNA 含量（nRPM）在局部體液中的中位數是血漿中的 160 倍。

討論

在 Illumina 和納米孔測序平臺上檢測細菌和真菌的靈敏度和特異性是相當的。體液 mNGS 在體液培養(yǎng)和 PCR 檢測為陰性的 12 個病例中有 7 例 (58.3%) 檢測到病原體，另有 2 例病原體 nRPM 低于閾值，凸顯了體液 mNGS 在感染診斷中的潛在用途。此前已發(fā)表的研究使用 mNGS 檢測膿毒癥和肺炎病原體的特異性分別為 63% 和 42.7%，在此研究獲得了 83% 到 100% 的總體特異性。

在這項研究中，mNGS 對金黃色葡萄球菌多次漏檢，這一差異在納米孔測序平臺上有顯著性，但在 Illumina 測序平臺上并沒有統計學意義。對金黃色葡萄球菌的檢測靈敏度降低被歸因于樣本中較高水平的宿主 DNA 背景。

對體液中游離核酸的檢測相較于去人源（差異化裂解）的優(yōu)勢在于：

1. 由于含有病原體 cfDNA 的上清液在差異裂解過程中被去除，這種富集方法可能不適用于低細胞密度的樣品，如血漿和腦脊液。

2. 差異裂解也會阻礙病毒和寄生蟲等其他微生物的檢測。此外，這些方法涉及多個步驟的裂解和離心，這會增加方法的復雜性，延長檢測周轉時間。

3. 不需要物理破壁，如玻璃珠勻質。勻質可能會提高對完整真菌和一些含有堅硬細胞壁的細菌的檢測，但在臨床實驗室的常規(guī)使用并不方便，而且會增加宿主 DNA 的釋放，從而降低微生物檢測靈敏度。
血漿游離核酸 mNGS 測序已被用于診斷深層感染。然而，細菌來源的 cfDNA 含量通常很低，約為每毫升血漿 5 個細菌基因組拷貝。研究表明在配對的樣本中，體液中觀察到的病原體 cfDNA 負荷量是對照組（血漿）的 160 倍。類似地，體液中的腫瘤 ctDNA 含量高于血漿中的 ctDNA。體液中更高水平的病原體 cfDNA 可以提高分析靈敏度，降低所需的測序深度，從而降低檢測成本。此外，直接從體液中鑒定病原體可以進行感染定位。
將 mNGS 與細菌 16S 或真菌 28S-ITS PCR 進行比較，14 例 mNGS 陽性患者中僅有 5 例通過 PCR 檢出。PCR 和 mNGS 之間不一致的結果也可能是由于體液中游離核酸的長度較短，PCR 無法有效擴增。

結論

使用納米孔測序可實現小于 6 小時的周轉時間，對于膿毒癥和重癥肺炎等需要快速診斷的患者可能是至關重要的。

mNGS 在以下四種情況有較大的臨床價值：(1) 用于鑒定培養(yǎng)陰性或生長緩慢的病原體；(2) 用于診斷罕見感染； (3) 作為危重病人的第一線檢測，以及 (4) 作為其他外送檢測的替代方案。